莫丹，陈喜裕，何婕，李新宁
（广西壮族自治区妇幼保健院 乳腺科，广西 南宁 530000）
乳腺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，也是女性因肿瘤死亡的第二大原因，新辅助化疗是局部进展期乳腺癌治疗的主要手段，尽管化疗药物不断改进，但化疗耐药依然是临床面临的一个重要挑战，严重影响患者预后[1]。化疗耐药机制复杂，目前研究[2]报道microRNA在调节肿瘤细胞对药物的耐药性和敏感性方面发挥重要作用。有研究[3]显示，microRNA-186-5p（miR-186-5p）可靶向胚胎发育调节因子抑制非小细胞肺癌细胞对顺铂耐药，并抑制耐药性癌细胞增殖、迁移及侵袭。MicroRNA-328-5p（miR-328-5p）可转录调控赖氨酰氧化酶样蛋白-2表达，有助于结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶治疗的抵抗[4]。miR-186-5p、miR-328-5p表达与乳腺癌患者化疗耐药是否有关尚不清楚。本研究通过检测乳腺癌患者血清miR-186-5p、miR-328-5p表达，分析其与乳腺癌患者临床病理特征和化疗耐药的关系，以期为临床乳腺癌治疗提供参考，现报道如下。
1.1 临床资料
选取2019年2月—2022年2月广西壮族自治区妇幼保健院乳腺癌患者105例作为乳腺癌组，另随机选取该院与乳腺癌患者年龄相匹配的57例健康体检女性作为对照组。乳腺癌组年龄47～62岁，平均（55.12±7.09）岁；
绝经62例；
T分期：T236例，T341例，T428例；
N分期：N063例，N125例，N217例；
病理类型：浸润性导管癌92例，其他13例；
雌激素受体（estrogen receptor, ER）阳性51例，孕激素受体（progesterone receptor, PR）阳性50例，人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2,HER2）阳性46例。对照组年龄45～64岁，平均（55.91±7.38）岁；
绝经32例。两组年龄、绝经比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。纳入标准：①经活检穿刺组织病理学证实为乳腺癌；
②拟行新辅助化疗；
③单侧乳腺癌；
④术前未接受放化疗。排除标准：①合并严重肝、肺、肾功能障碍；
②合并其他部位恶性肿瘤；
③发生远处转移，接受保守治疗者；
④合并神经系统或精神疾病。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者及其家属签署同意书。
1.2 化疗方案
乳腺癌患者均接受新辅助化疗，按照《中国临床肿瘤学会乳腺癌诊疗指南（2017.V1）》[5]的治疗方案进行。HER-2阴性患者接受8个周期的ACT方案化疗：第1天环磷酰胺（注册证号：JX20100188，规格：0.2 g/支，美国百特国际有限公司）600 mg/m2+吡柔比星（国药准字：H20045983，规格：10 mg/瓶，浙江瀚晖制药有限公司）60 mg/m2静脉滴注，21 d为1个周期，共化疗4个周期。4周期后第1天给予多西他赛（国药准字：H20193016，规格：20 mg/支，四川汇宇制药股份有限公司）100 mg/m2静脉滴注，21 d为1个周期，共化疗4个周期。HER-2阳性患者接受8个周期的ACTH方案化疗：第1天环磷酰胺600 mg/m2+吡柔比星60 mg/m2静脉滴注，21 d为1个周期，共化疗4个周期。4周期后第1天给予多西他赛100 mg/m2+曲妥珠单抗（注册证号：BS20020036，规格：440 mg，瑞士罗氏公司）8 mg/kg静脉滴注，21 d为1个周期，共化疗4个周期。治疗结束后参考实体瘤疗效评价标准RECIST（1.1版）[6]评价疗效：以客观缓解（病灶完全消失，任何病理性淋巴结的短轴值必须＜10 mm），部分缓解（所有可测量目标病灶的直径总和低于基线≥30%），疾病稳定（以目标病灶半径的总和最小值为参照，既达不到客观缓解、部分缓解标准、也达不到疾病进展标准）为敏感，以疾病进展（病灶增大＞ 25%或出现新病灶）为耐药，根据化疗反应分为耐药组30例，敏感组75例。
1.3 qRT-PCR检测血清miR-186-5p、miR-328-5p表达
所有患者均于新辅助化疗前采集静脉血3 mL，对照组于体检当日采集。采集后的静脉血注入干燥试管，待凝固后取上层液离心（3 000 r/min，5 min，半径10 cm）分离血清，上机检测。TRIzol法提取细胞总RNA，用紫外分光光度计分别在260 nm和280 nm处检测吸光度，260/280 nm吸光度比值为1.8～2.0，取该比值区间的RNA进行后续实验，用M-MLV逆转录酶将其逆转录为cDNA。逆转录反应条件：15℃ 30 min，45℃ 30 min，85℃ 5 min 灭活。qRTPCR检测miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相对表达量，反应体系：cDNA 1μL，正反向引物各0.4 μL，2×TransTaq®Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye（50×）0.4 μL，最后添加ddH2O至20 μL。反应条件：50℃预变性2 min，97℃变性20 s，60℃退火20 s，70℃延伸15 s，共40个循环。引物序列由宝生物工程（大连）有限公司设计。miR-186-5p正向：5"-AAGAATTCTCCTTTTGGGCT-3"，反向：5"-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3"；
miR-328-5p正向：
5"-AACGAGACGACGACAGAC-3"，反向：
5"- GGGGGG GCAGGAGGGGCTCAGGG-3"。U6正向：
5"-CTCGCTT CGGCAGCACA-3"，反向：5"-ACGCTTCACGAATTTGC GT-3"。以U6为内参，按照2-ΔΔCt计算miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相对表达量。
1.4 统计学方法
数据分析采用SPSS 25.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；
计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验；
绘制受试者工作特征（ROC）曲线；
影响因素的分析采用多因素Logistic逐步回归模型。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 乳腺癌组和对照组血清miR-186-5p、miR-328-5p表达的比较
乳腺癌组和对照组血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），乳腺癌组血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相对表达量低于对照组。见表1。
表1 两组血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相对表达量比较 （±s）
表1 两组血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相对表达量比较 （±s）
组别乳腺癌组对照组t 值P 值n 105 57 miR-186-5p mRNA 2.03±0.49 4.84±1.37 18.943 0.000 miR-328-5p mRNA 1.85±0.36 4.02±1.16 17.701 0.000
2.2 不同临床病理特征乳腺癌患者血清miR-186-5p、miR-328-5p表达的比较
不同T、N分期及HER-2的乳腺癌患者血清miR-186-5p、miR-328-5pmRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），T3、T4期、N1～3期、HER-2阳性乳腺癌患者血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相对表达量低于T2期、N0期、HER-2阴性乳腺癌患者。不同年龄、是否绝经、病理类型、ER、PR状态乳腺癌患者血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。
表2 不同临床病理特征乳腺癌患者血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相对表达量比较 （±s）
表2 不同临床病理特征乳腺癌患者血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相对表达量比较 （±s）
注 ：
年龄根据中位数界定。
临床病理特征年龄≥ 55岁＜ 55岁绝经是否病理类型浸润性导管癌其他类型T分期T2期T3、T4期N分期N0期N1～3期ER阴性阳性PR阴性阳性HER-2阴性阳性n 59 46 62 43 92 13 36 69 63 42 54 51 55 50 59 46 miR-186-5p mRNA 2.01±0.50 2.06±0.43 2.02±0.48 2.04±0.50 2.02±0.47 1.95±0.41 2.24±0.14 1.92±0.23 2.15±0.17 1.85±0.19 2.02±0.48 2.04±0.46 2.04±0.50 2.02±0.46 2.14±0.21 1.89±0.20 t 值0.540 0.206 0.510 7.632 8.500 0.218 0.213 6.179 P 值0.590 0.837 0.611 0.000 0.000 0.828 0.832 0.000 miR-328-5p mRNA 1.83±0.39 1.88±0.36 1.84±0.33 1.86±0.35 1.84±0.35 1.92±0.36 1.93±0.10 1.81±0.13 1.90±0.16 1.77±0.10 1.86±0.36 1.84±0.34 1.82±0.35 1.88±0.36 1.89±0.13 1.80±0.15 t 值0.674 0.298 0.769 4.838 4.687 0.292 0.865 3.290 P 值0.502 0.766 0.444 0.000 0.000 0.771 0.389 0.001
2.3 耐药组和敏感组血清miR-186-5p、miR-328-5p表达的比较
耐药组和敏感组血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），耐药组血清miR-186-5p、miR-328-5p mRNA相对表达量低于敏感组。见表3。
表3 耐药组和敏感组血清miR-186-5p、miR-328-5p表达的比较 （±s）
表3 耐药组和敏感组血清miR-186-5p、miR-328-5p表达的比较 （±s）
组别耐药组敏感组t 值P 值n 30 75 miR-186-5p mRNA 1.95±0.11 2.06±0.21 2.718 0.008 miR-328-5p mRNA 1.79±0.10 1.87±0.16 2.543 0.013
2.4 影响乳腺癌患者新辅助化疗疗效的多因素Logistic逐步回归分析
以影响乳腺癌患者新辅助化疗疗效为因变量（敏感= 0，耐药= 1），以单因素分析中差异有统计学意义的指标[miR-186-5p（原始数值）、miR-328-5p（原始数值）、T分期（T2期= 0，T3、T4期= 1）、N分期（N0期= 0，N1～3期= 1）]为自变量，进行多因素Logistic逐步回归分析，α入=0.05，α出=0.10，结果显示：N分期[=3.497（95% CI：1.737，7.041）]、miR-186-5p [=1.680（95% CI：1.169，2.415）]、miR-328-5p [=1.519（95% CI：1.134，2.034）]是影响乳腺癌患者新辅助化疗效果的危险因素（P＜0.05）。见表4。
表4 影响乳腺癌患者新辅助化疗效果的多因素Logistic逐步回归分析参数
2.5 miR-186-5p、miR-328-5p预测乳腺癌患者新辅助化疗效果的价值
ROC曲线分析结果显示，miR-186-5p、miR-328-5p及两者联合预测乳腺癌患者新辅助化疗效果的敏感性分别为76.67%（95% CI：0.553，0.856）、70.00%（95% CI：0.510，0.808）、90.00%（95% CI：0.768，0.977），特异性分别为74.67%（95% CI：0.528，0.831）、76.00%（95% CI：0.544，0.840）、90.67%（95% CI：0.776，0.984）。见表5和图1。
图1 miR-186-5p、miR-328-5p预测乳腺癌患者新辅助化疗效果的ROC曲线
表5 miR-186-5p、miR-328-5p预测乳腺癌患者新辅助化疗效果的效能分析
新辅助化疗可最大程度缩小肿瘤体积，实现降期保乳或手术转化的可能，可改善局部进展期乳腺癌预后，延长生存期，提高生活质量，但是化疗耐药的发生极大程度限制其治疗效果，最终可能导致治疗失败，缩短患者生存期[7]。最近研究[8]表明，肿瘤细胞可分泌外泌体，外泌体通过与质膜融合分泌到细胞外空间，与邻近或远处细胞进行信号转导，调节癌细胞对治疗的抵抗性。外泌体中含有蛋白质、脂质及大量miRNA，miRNA是小的非编码RNA，可在转录后水平控制多个靶基因表达，外泌体中miRNA表达稳定，并通过转移miRNA促使多种类型肿瘤细胞产生化学抗性。
miR-186-5p属于miR-186家族，miR-186位于染色体1q31.1，基因转录后产生pre-miR-186，其在Dicer作用下裂解为miR-186-5p和miR-186-3p。自从发现胰腺癌中miR-186-5p表达失调以来，已有研究[9]证实miR-186-5p在非小细胞肺癌、口腔鳞状细胞癌、肝细胞癌等多种类型恶性肿瘤中表达失调，并参与细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭，以及新生血管和淋巴管生成过程。现有报道[10-11]显示，miR-186-5p在骨肉瘤组织和细胞系中表达下调，miR-186-5p过表达可通过靶向FOXK1 3"-UTR并负调控其表达，抑制癌细胞增殖、迁移及侵袭，miR-186-5p还可靶向胰岛素样生长因子1抑制宫颈癌细胞增殖、迁移及凋亡。本研究发现，miR-186-5p在乳腺癌患者血清中表达下调，miR-186-5p低表达与T、N分期，HER-2表达均有关，表明miR-186-5p在乳腺癌中可能发挥抑癌基因作用。miR-186-5p可能通过靶向锌指E-盒结合同源异形盒-1，抑制上皮间质转化和乳腺癌细胞的迁移、侵袭[12]，miR-186-5p还可能通过靶向抑制CXC趋化因子受体4释放，抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭[13]。进一步分析发现，miR-186-5p是乳腺癌患者新辅助化疗耐药的保护因素，miR-186-5p表达缺失与乳腺癌化疗耐药有关，分析原因：首先，ATP结合盒转运蛋白尤其是由ABC亚家族B成员1编码的多药耐药相关蛋白1可赋予癌细胞对细胞毒性和靶向化疗的抵抗力，导致化疗耐药[14]，miR-186-5p可靶向抑制多药耐药相关蛋白1表达，增加乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性[15]。其次，线粒体转录因子A可驱动mtDNA的转录和复制、线粒体基因的维持和修复，在维持线粒体呼吸链的功能完整性方面发挥重要作用，并通过诱导线粒体启动免疫反应对化疗产生抗性[16]，miR-186-5p通过靶向抑制线粒体转录因子A增强乳腺癌细胞对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性[17]。
miR-328-5p是一种肿瘤相关基因，位于人类染色体16q22.1，参与肝细胞癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤发生和进展。有报道[18-19]显示，miR-328-5p过表达可增加Snail和波形蛋白的表达，促进上皮间质转化过程增强肝细胞癌恶性行为，促使肝细胞癌生长，但miR-328-5p在结直肠癌中表达下调，上调miR-328-5p表达可靶向转录因子E2F1抑制细胞周期素E表达，抑制结直肠癌细胞增殖转移。本研究显示，乳腺癌患者血清miR-328-5p表达明显下调，且miR-328-5p低表达与乳腺癌恶性生物学行为有关，miR-328-5p可通过直接靶向糖基化终产物调控细胞周期，抑制乳腺癌细胞增殖，发挥抑癌基因作用[20]，miR-328-5p还可靶向mimic+整合素α5下调磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路，抑制乳腺癌细胞增殖，促使其凋亡[21]。本研究耐药组血清miR-328-5p表达低于敏感组，miR-328-5p是乳腺癌患者新辅助化疗耐药的保护因素，表明miR-328-5p表达缺失与乳腺癌患者术后化疗耐药有关。分析miR-328-5p参与乳腺癌化疗耐药的机制：自噬参与乳腺癌对化疗耐药的机制。有研究[22]显示，自噬关键介质Beclin1的过表达可抑制雌激素信号转导，导致ER阳性乳腺癌对他莫昔芬耐药，抑制Atg5、Atg7、Beclin1等自噬基因将导致对他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞重新获得敏感。整合素家族中整合素α5可激活局部黏着斑激酶/细胞外信号调节激酶通路诱导细胞自噬[23]，miR-328-5p可通过抑制整合素家族中整合素α5表达抑制细胞自噬，增强乳腺癌细胞对化疗的敏感性[24]。
综上所述，乳腺癌患者血清miR-186-5p、miR-328-5p表达下调，miR-186-5p、miR-328-5p低表达与乳腺癌患者T、N分期及化疗耐药有关，miR-186-5p、miR-328-5p可作为乳腺癌患者病理分型及新辅助化疗效果参考的生物学标志物，为临床病情评估和治疗提供指导。
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