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circZMIZ1调节miR-214-3p/GPX4轴对前列腺癌细胞铁死亡的影响①

时间:2024-01-13 08:15:01 来源:网友投稿

张爱建 秦红艳 郑宝寿 王剑华 (大理大学第一附属医院泌尿外科,大理 671000)

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是男性常见的恶性肿瘤之一,严重威胁患者的健康[1-2]。铁死亡是一种新的受调控的细胞死亡形式,其特征在于细胞内亚铁离子(Fe2+)的产生、活性氧(reactive oxygen species,ROS)的积累和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)的失活[3]。GPX4 在铁死亡中起关键作用,是铁死亡的抑制剂。据报道,GPX4 在PCa 中呈高表达,下调其表达可诱导PCa 细胞 铁 死 亡[4]。故GPX4 是PCa 的 重 要 调 控 靶 点。miR-214-3p 是一种在癌症中被广泛研究的抑制性miRNA,在PCa 组织中表达下调,也是PCa 肿瘤发生的关键调节因子[5]。研究显示,GPX4 是miR-214-3p的直接靶标[6-7]。然而,PCa 中GPX4 高表达是否与miR-214-3p表达降低有关尚未明确。

环状RNA(circRNA)在包括PCa 在内的肿瘤发生中发挥关键作用[8]。最近的一项研究显示,circ-ZMIZ1 在PCa 患者中呈高表达,参与了PCa 的发生和发展;
敲低circZMIZ1 可抑制PCa 细胞增殖[9]。通过生物信息学预测网站预测circZMIZ1 可能吸附的miRNA,发现miR-214-3p 是circZMIZ1 的候选靶标之一。circZMIZ1 是否可通过与miR-214-3p 相互作用调节PCa 细胞的铁死亡仍不清楚。因此,本研究旨 在 探 讨PCa 细 胞 中circZMIZ1、miR-214-3p 和GPX4之间的相互作用和功能关联。

1.1 材料

1.1.1 细胞与实验动物 20 只雄性BALB/c 裸鼠(4周龄,体质量20 g)购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[许可证号:SCXK(鲁)20190003],并饲养在特定的无病原体环境中。人正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)购自美国ATCC 细胞库(EY-X0718);
PCa细胞系(22Rv1、VCaP、PC3 和DU145)购自武汉普诺赛生命科技有限公司(CL-0004、CL-0241、CL-0185、CL-0075);
所有细胞于37 ℃和5%CO2条件下在含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素G和100 µg/ml链霉素的RPMI1640 培养基中培养。慢病毒载体由上海GenePharma公司构建。

1.1.2 主要试剂与仪器 靶向circZMIZ1 的小分子干扰RNA(si-circZMIZ1)、miR-214-3p mimic、miR-214-3p inhibitor 及其阴性对照(si-NC、miR-NC、inhibitor-NC)由广州Ribobio 设计和合成;
MTT 细胞增殖检测试剂盒(M1020)、膜联蛋白V(Annexin-V)- FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(CA1020)购自北京Solarbio 公司;
乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)(A020-1-2)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)(A003-1-2)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)(A006-2-1)检测试剂盒购自南京建成生物技术研究所;
Fe2+检测试剂盒(E-BC-K304-S)购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;
ROS 检测试剂盒(YT290)购自北京百奥莱博科技有限公司;
Magna RIP 试剂盒(17-700)购自Millipore;
兔抗人GPX4抗体(ab125066)购自英国Abcam公司;
ABI Prism®7500型荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems 公司;
FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD Biosciences 公司;
IX53/DP80 荧光显微镜购自日本Olympus 公司;
生物素标记的野生型或突变型miR-214-3p(Biotin-miR-214-3p-WT 或Biotin-miR-214-3p-MUT)探针由广州Ribo-Bio合成。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR 检测细胞circZMIZ1、miR-214-3p和GPX4 表达 使用Trizol 试剂从RWPE-1 细胞和PCa 细胞中提取总RNA,使用cDNA 合成试剂盒将总RNA 逆转录为cDNA,随后在ABI Prism®7500 型荧光定量PCR 仪上使用SYBR Green Super Mix 试剂盒进行PCR 扩增。热循环条件如下:95 ℃ 10 min,95 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s 的40 个循环。引物序列见表1。GAPDH 为circZMIZ1 和GPX4 mRNA表达水平标准化的内部对照,U6为miR-214-3p表达水平标准化的内部对照,使用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.2.2 Western blot 检测细胞GPX4 蛋白表达 使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解缓冲液提取RWPE-1 细胞和PCa 细胞总蛋白,BCA 蛋白测定试剂测定蛋白浓度。SDS-PAGE 凝胶电泳分离等量蛋白样品(40 µg)并转移到聚偏二氟乙烯膜。将膜用5%脱脂牛奶封闭1 h 后,与一抗GPX4 和GAPDH (1∶1 000)在4 ℃下孵育过夜,然后将膜与适当的HRP偶联二抗在室温下孵育1 h。通过电化学发光试剂观察免疫反应条带。Image J 软件测定蛋白条带的灰度值,目的蛋白与GAPDH 灰度值的比值用于统计分析。

1.2.3 双荧光素酶报告基因检测 使用StarBase数据库(https://starbase.sysu.edu.cn/index.php)预测miR-214-3p 与circZMIZ1 和GPX4 之间的结合位点。circZMIZ1 和GPX4 mRNA 的部分序列(包含与miR-214-3p 的互补结合位点)通过PCR 扩增并克隆到pmirGLO 载体中,这些野生型报告质粒被称为WT-circZMIZ1 和WT-GPX4。此外,将circZMIZ1 和GPX4 mRNA 中的突变序列构建到pmirGLO 载体中以产生MUT-circZMIZ1 和MUT-GPX4。对于荧光素酶活性测定,将PC3 细胞以1×105个/孔的密度接种至24孔板,使用Lipofectamine 3000将这些荧光素酶重组质粒与miR-214-3p mimic 或对照(miR-NC)共转染至PC3 细胞。37 ℃、5%CO2条件下培养48 h后,使用双荧光素酶报告基因检测系统检测萤火虫荧光素酶活性,并将其标准化为海肾荧光素酶活性。

1.2.4 RNA pull-down 分析 将PC3 细胞在含有RNase 抑制剂的裂解缓冲液中裂解。将细胞裂解物(2 µg)与100 pmol Biotin-miR-214-3p-WT 或BiotinmiR-214-3p-MUT 共同孵育2 h。将链霉亲和素琼脂糖珠加入反应体系中,室温孵育1 h。随后,在裂解缓冲液中洗涤糖珠,与糖珠结合的RNA 被捕获并用Trizol提取,应用qRT-PCR检测circZMIZ1水平。

1.2.5 RNA 结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)检测 采用含有RNase抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞。将含有Argonaute-2抗体(Ago2)或免疫球蛋白G 抗体(IgG)的琼脂糖珠与细胞裂解物在4 ℃下孵育过夜。然后,将糖珠洗涤并与蛋白酶K 共同孵育以去除蛋白质。最后,提取免疫沉淀的RNA,并通过qRT-PCR 检测circ-ZMIZ1和miR-214-3p的富集。

1.2.6 细胞转染 将PC3 细胞接种至6 孔板(1×105个/孔)并培养过夜。使用Lipofectamine 3000 试剂 将si-NC、si-circZMIZ1、inhibitor-NC、miR-214-3p inhibitor 转染到细胞中。实验分为:对照组(NC 组,无转染)、si-NC 组(转染si-circZMIZ1 阴性对照si-NC)、si-circZMIZ1 组(转染si-circZMIZ1)、si-circ-ZMIZ1+anti-NC 组(si-circZMIZ1 和miR-214-3p inhibitor 阴性对照inhibitor-NC 共转染)、si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 组(si-circZMIZ1 和miR-214-3p inhibitor 共转染)。转染6 h,继续培养48 h 后,收集细胞,qRT-PCR 检测细胞中circZMIZ1、miR-214-3p 和GPX4 mRNA 的表达水平,并采用Western blot 检测细胞中GPX4蛋白表达。

1.2.7 MTT 法检测细胞增殖活性 将转染48 h 后的各组PC3细胞以5×103个/孔接种至96孔板。培养24 h、48 h 和72 h 后,向培养基中加入10 µl MTT 溶液(5 mg/ml),置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养4 h。随后,以100 µl/孔加入DMSO 溶解甲臜产物。采用酶标仪检测570 nm处的吸光度值。

1.2.8 LDH 活性检测 在6 孔板的每孔中接种 1×105个细胞,转染48 h 后,收集细胞培养上清液并与反应混合物混合。孵育30 min 后,在440 nm 处测量吸光度(A)评估LDH水平。

1.2.9 流式细胞术检测细胞凋亡 将转染48 h 后的细胞用胰蛋白酶化消化、离心并重悬于500 µl 1×结合缓冲液中(5×105个),将细胞在黑暗中采用 5 µl Annexin-V-FITC 和5 µl PI 染色15 min 后,通过流式细胞术分析细胞凋亡。细胞凋亡率为细胞早期凋亡(Annexin V+PI-)和晚期凋亡(Annexin V+PI-)的百分比总和。

1.2.10 Fe2+含量和MDA、GSH水平测定 使用Fe2+检测试剂盒测定细胞内Fe2+水平。收集转染48 h 后的各组细胞并采用PBS 洗涤2 次,随后采用细胞裂解液裂解细胞。在4 ℃下以13 000 g离心10 min,弃去沉淀物,收集上清液。将上清液与铁还原剂在室温下孵育30 min 后,与铁探针混合并在室温下孵育1 h。使用酶标仪在593 nm 波长处测量吸光度,绘制标准曲线并计算Fe2+浓度。应用MDA、GSH 测定试剂盒检测上清液中MDA含量和细胞内GSH水平。

1.2.11 ROS 活性测定 将细胞接种至6 孔板,转染培养48 h 后,除去原培养基,将细胞在培养箱中用含10 µmol/L DCFH-DA 染料的新鲜培养基在37 ℃下避光染色30 min。收集细胞,洗涤并悬浮在PBS中,使用荧光显微镜进行观察。

1.2.12 裸鼠成瘤实验 20只雄性BALB/c裸鼠分为si-NC 组、si-circZMIZ1 组、si-circZMIZ1+anti-NC 组和si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p组(每组5只)。si-circ-ZMIZ1、miR-214-3p inhibitor 或si-NC、inhibitor-NC 分别通过慢病毒载体转染PC3细胞获得稳定表达。随后,BALB/c 裸鼠皮下注射转染后的PC3 细胞悬液(2×106个/200 µl)。接种后每周使用游标卡尺评估肿瘤体积(V=1/2×a×b2,a:肿瘤长度;
b:肿瘤宽度);

4 周后,处死裸鼠,收获肿瘤组织,立即测量肿瘤重量。将肿瘤组织分为两部分,一部分用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋,用于免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色;
另一部分-80 ℃冰箱保存,采用qRT-PCR检测circZMIZ1、miR-214-3p和GPX4的表达。

1.2.13 IHC 染 色 检 测肿瘤组织Ki-67 和GPX4 的表达 取4%多聚甲醛固定的肿瘤组织,石蜡包埋, 切成4 µm 切片。将切片在4 ℃下与一抗Ki-67 (1∶100)和GPX4(1∶100)共同孵育过夜。然后,加入二抗(1∶200)在室温下孵育30 min。DAB显色,苏木精复染1 min。封片,在光学显微镜下观察Ki-67和GPX4 的阳性表达,并用Image-Pro Plus 6.0 软件计算平均光密度(mean optical density,MOD)。

1.3 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0 软件进行数据分析。计量资料以±s表示。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2.1 circZMIZ1、miR-214-3p 和GPX4 在PCa 细胞中的表达水平 与RWPE-1 细胞相比,PCa 细胞系(22Rv1、VCaP、PC3 和DU145)中circZMIZ1、GPX4 mRNA和GPX4蛋白水平显著升高,miR-214-3p水平显著降低(P<0.05);
其中,PC3 细胞中circZMIZ1、GPX4 mRNA 和GPX4 蛋白水平明显高于其他细胞系,miR-214-3p 水平明显低于其他细胞系,故选择PC3细胞进行后续实验。见图1。

图1 不同PCa 细胞中circZMIZ1、miR-214-3p 和GPX4 水平比较Fig.1 Comparison of circZMIZ1, miR-214-3p and GPX4 levels in different PCa cells

2.2 circZMIZ1、miR-214-3p 和GPX4 的调控关系验证 StarBase数据库预测了circZMIZ1和miR-214-3p的靶向结合序列(图2A)。双荧光素酶检测结果显示,与转染miR-NC 相比,转染miR-214-3p mimic后,含有WT-circZMIZ1 质粒细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.05),而含有MUT-circZMIZ1 质粒细胞的荧光素酶活性无显著变化(P>0.05,图2B)。RNA pull-down 结果显示,circZMIZ1 被生物素标记的miR-214-3p(Biotin-miR-214-3p-WT)拉下,而不是突变体Biotin-miR-214-3p-MUT(图2C)。RIP测定结果显示,相对于IgG 对照组,circZMIZ1 和miR-214-3p在Ago2 免疫沉淀中显著富集(P<0.05,图2D)。此外,StarBase 数据库预测显示GPX4 的3"UTR 包含miR-214-3p 的可能结合位点(图2E)。双荧光素酶检测结果显示,与转染miR-NC 相比,转染miR-214-3p mimic 后,含有WT-GPX4 质粒细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.05),而含有MUT-GPX4 质粒细胞的荧光素酶活性无显著变化(P>0.05,图2F)。qRTPCR 和Western blot 结果显示,与NC 组相比,si-circ-ZMIZ1 组circZMIZ1、GPX4 mRNA 和GPX4 蛋白水平显著降低,miR-214-3p 水平显著升高(P<0.05);
与si-circZMIZ1 组、si-circZMIZ1+anti-NC 组相比,si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 组GPX4 mRNA 和GPX4 蛋白水平显著升高,miR-214-3p 水平显著降低(P<0.05,图2G~K)。

图2 circZMIZ1、miR-214-3p和GPX4的调控关系验证Fig.2 Verification of regulatory relationship of circ-ZMIZ1, miR-214-3p and GPX4

2.3 敲低circZMIZ1对PC3细胞的影响 MTT结果显示,在48 h、72 h 时,与NC 组相比,si-circZMIZ1 组PC3 细胞增殖活性显著降低(P<0.05);
与si-circ-ZMIZ1组、si-circZMIZ1+anti-NC组相比,si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 组PC3 细胞增殖活性显著升高(P<0.05,图3A)。与NC 组相比,si-circZMIZ1 组PC3 细胞培养上清液中LDH 水平显著升高(P<0.05);
与si-circZMIZ1组、si-circZMIZ1+anti-NC组相比,si-circ-ZMIZ1+anti-miR-214-3p 组LDH 水平显著降低(P<0.05,图3B)。流式细胞术结果显示,与NC 组相比,si-circZMIZ1组PC3细胞凋亡率显著升高(P<0.05);
与si-circZMIZ1 组、si-circZMIZ1+anti-NC 组相比,sicircZMIZ1+anti-miR-214-3p 组细胞凋亡率显著降低(P<0.05,图3C、3D)。此外,与NC 组相比,si-circ-ZMIZ1 组Fe2+含量和MDA、ROS 水平显著升高,GSH水平显著降低(P<0.05);
与si-circZMIZ1 组、si-circ-ZMIZ1+anti-NC 组相比,si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 组Fe2+含量和MDA、ROS 水平显著降低,GSH 水平显著升高(P<0.05,图3E~I)。

图3 敲低circZMIZ1对PC3细胞的影响Fig.3 Effect of circZMIZ1 knockdown on PC3 cells

2.4 敲低circZMIZ1 对裸鼠移植瘤生长的影响 与si-NC 组相比,si-circZMIZ1 组肿瘤体积和重量显著降低(P<0.05);
与si-circZMIZ1 组、si-circZMIZ1+anti-NC 组相比,si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 组肿瘤体积和重量显著升高(P<0.05,图4A、4B)。免疫组织化学染色结果显示,与si-NC 组相比,si-circ-ZMIZ1 组肿瘤组织中Ki-67 和GPX4 阳性表达显著降低(P<0.05);
与si-circZMIZ1 组、si-circZMIZ1+anti-NC 组相比,si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 组肿瘤组织中Ki-67 和GPX4 阳性表达显著升高(P<0.05,图4C、4D)。qRT-PCR结果显示,与si-NC组相比,sicircZMIZ1 组肿瘤组织中circZMIZ1 和GPX4 mRNA水平显著降低,miR-214-3p 水平显著升高(P<0.05);
与si-circZMIZ1 组、si-circZMIZ1+anti-NC 组相比,si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 组肿瘤组织中GPX4 mRNA水平显著升高,miR-214-3p水平显著降低(P<0.05,图4E)。

图4 敲低circZMIZ1对裸鼠移植瘤生长的影响Fig.4 Effect of circZMIZ1 knockdown on tumor growth in nude mice

铁死亡是一种细胞死亡形式,其特征在于细胞中铁依赖性脂质过氧化物的积累。引发铁死亡已成为一种有前途的癌症治疗策略,包括PCa[4,10]。circRNA 是通过选择性剪接从其亲本线性RNA衍生而来的闭合环状RNA。由于其高稳定性和对RNase的抗性,circRNA 成为早期诊断和治疗多种癌症的理想生物标志物。最近的研究表明,circRNA 可调节肿瘤细胞中的铁死亡[11]。据报道,circZMIZ1 在PCa 中上调,敲低其表达可抑制PCa 细胞增殖并导致细胞周期停滞[9]。在本研究中,circZMIZ1 在PCa细胞系中的表达明显高于人正常前列腺上皮细胞,敲低circZMIZ1 可降低PCa 细胞活力和体内肿瘤生长,并诱导PCa 细胞凋亡,与既往研究一致。表明circZMIZ1 可能在PCa 进展中发挥重要作用,但其对PCa铁死亡的作用仍不清楚。

circRNA 通过作为miRNA 海绵调控miRNA 介导的靶mRNA 表达[12]。为了研究circZMIZ1 介导的PCa 发生发展的潜在机制,通过生物信息学数据库探索了circZMIZ1 介导的竞争性内源性RNA 网络,发现miR-214-3p 是circZMIZ1 的候选靶标之一。miR-214-3p 已被证实是PCa 的肿瘤抑制因子[5]。与既往的研究一致,在本研究中miR-214-3p 在PCa 细胞系中呈低表达。由于miR-214-3p 与circZMIZ1 在PCa 中的表达趋势相反及其在多种癌症中的抑癌作用,因此选择miR-214-3p 进行进一步实验。通过双荧光素酶报告基因分析、RNA pull-down 实验和RIP实验证实miR-214-3p 与circZMIZ1 在PCa 细胞中的直接靶标相互作用。随后,通过使用qRT-PCR 分析circZMIZ1 敲低对miR-214-3p 的影响,结果显示, circZMIZ1 敲低可升高miR-214-3p 表达,且下调miR-214-3p 可明显减弱circZMIZ1 敲低对PCa 细胞增殖和体内移植瘤生长的抑制作用和凋亡的促进作用。提示,circZMIZ1通过海绵化下调miR-214-3p表达促进PCa进展。

此外,GPX4 是miR-214-3p 的靶标。HE 等[6]的研究显示,上调miR-214-3p 可抑制GPX4 表达,进而抑制肝癌细胞的活力并诱导铁死亡。在本研究中,生物信息学分析揭示了miR-214-3p 与GPX4 mRNA的3"UTR 之间的潜在相互作用,双荧光素酶报告基因测定随后验证了miR-214-3p 和GPX4 在PCa 细胞中的直接相互作用。qRT-PCR 和Western blot 检测人PCa 细胞系中GPX4 的表达,发现GPX4 的mRNA和蛋白水平在PCa 细胞中呈高表达,与PCa 中miR-214-3p的表达趋势相反,与circZMIZ1的表达趋势一致。作为铁死亡的关键抑制剂,GPX4 与GSH 相互作用以减少生物膜内的过氧化物酶反应,从而抑制脂质ROS 的积累和铁死亡的激活[13]。铁死亡诱导的细胞膜结构破坏可导致细胞外释放LDH。在本研究中,细胞死亡生物标志物LDH 水平升高证实了circZMIZ1 敲低后诱导的细胞铁死亡。铁死亡的独特生化特征包括积累的亚铁和脂质ROS。因此,本研究评估了Fe2+、ROS 和脂质过氧化MDA 的积累,结果显示,circZMIZ1 敲低在上调miR-214-3p 表达,降低GPX4 表达的同时增加了Fe2+和MDA、ROS 的产生,降低了GSH 水平;
且下调miR-214-3p 可明显升高GPX4 表达,降低了circZMIZ1 敲低诱导的铁沉积和ROS、MDA 水平。以上提示,circZMIZ1 敲低可能通过miR-214-3p/GPX4 轴在PCa 细胞中引发铁死亡。

综上所述,敲低circZMIZ1 可能通过miR-214-3p/GPX4 轴诱导PCa 细胞铁死亡。本研究结果将为PCa 的治疗提供新的见解和靶点。但本研究仅评估了一种PCa 细胞系,在未来的研究中将采用其他PCa细胞系进行验证。

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