常 越，唐 翠，徐 辉，曹相玫，刘仲涛
（1.宁夏医科大学基础医学院病理学系，银川 750004；
2.宁夏医科大学总医院神经外科，银川 750004）
CD47蛋白也称为整联素关联蛋白（integrinassociated protein，IAP），分子质量为50 kDa，属于免疫球蛋白超家族中的一员，是普遍分布于细胞外表面的跨膜蛋白。已知CD47的天然配体有：整合素、血小板凝集素-1和信号调节蛋白α（SIRPα），CD47可以和SIRPγ有微弱的结合[1-2]。研究[3]表明，CD47经过与其配体联合阻碍巨噬细胞介导的吞噬作用，从而逃脱免疫监督。所以，CD47参与的生物学作用包括细胞的黏附、迁移及抑制巨噬细胞吞噬调节炎性反应[4]。近年来，CD47在免疫治疗方面研究较多，抗肿瘤T细胞免疫作用可通过抗CD47抗体的介导促进巨噬细胞吞噬功能的启动[5-7]。相较于CD47低表达的肿瘤细胞，高表达CD47的肿瘤细胞有更强的存活能力，因而CD47高表达的肿瘤细胞可以避免被先天免疫系统攻击[8-9]。CD47作为一种避免巨噬细胞吞噬的信号分子，将有可能成为某些癌症的治疗靶点。因此，本研究构建了hCD47基因重组慢病毒并检测了其在人胶质瘤U87细胞中的表达，为进一步研究CD47基因在恶性肿瘤中的生物学功能及重要意义奠定基础。
1.1 材料
慢病毒载体pLVX-mCMV-ZsGreen-IRESPuro、293T、U87细胞、HEK293细胞系（北京西贝宏程生物科技有限公司）；
GeneCopoeiaGCI-L3化学感受态细胞、HEK293T慢病毒包装细胞系（北京博迈德基因技术有限公司）；
离心管、DMEM培养液、PVDF、胎牛血清、青链霉素双抗、无血清培养液和胰酶（宁夏朗凯生物科技有限公司）；
针头滤器（美国Millipore公司）；
凝聚胺（polybrene）、质粒抽提试剂盒（上海玉博生物科技有限公司）；
NotI、BamHI限制性内切酶（New England Biolabs有限公司），DNA Ladder Marker（北京诺尔塞克科技有限公司），琼脂糖凝胶回收试剂盒（美国Omega公司），In-Fusion PCR Cloning Kit（美国Clontech公司），Taq polymerase、dNTP（北京义翘神州科技股份有限公司）。
1.2 方法
1.2.1hCD47目的基因扩增hCD47mRNA的DNA序列从GenBank资料库中获得，引物根据目的基因的载体位点和序列设计合成，上游引物5’-CTAGGCGGCCGCGCCACCATGTGGC CCCTGGTA GCGGCGCTG-3’（含有NotI酶切位点），下游引物5’-CGCGGATCCTTACTTGTCCGTCATCCTTG-3’（含有BamHI酶切位点），利用聚合酶链式反应（PCR）扩增。PCR反应体系：5×FastPfu Buffer 15μL，dNTP Mix（2.5 mmol·L-1）5μL，正向及反向引物各（10μmol·L-1）1μL，FastPfu polymerase 2μL，模板DNA（100 ng·μL-1）1μL，ddH2O 25μL，合计50μL总体系。PCR反应流程参考文献[10]，变性：95℃预加热5 min，使DNA完全变性；
退火：95℃迅速降温至55℃退火30 s，使模板与引物充分退火；
延伸：72℃延伸2 min，重复循环35次，最后，72℃保持10 min，使产物延伸完整。
1.2.2 hCD47重组慢病毒载体构建和鉴定[11]慢病毒载体质粒pLVX 2μg，10×CutSmart Buffer 2μL，各取1μL的NotI和BamHI，加ddH2O补足至总体系20μL，酶切反应在37℃水浴反应3 h。取25μL目的基因质粒pcDNA3.1-hCD47，10×Buffer CutSmart 3μL，NotI和BamHI各1μL，加ddH2O补足至30μL。1%的琼脂糖凝胶电泳回收质粒pLVX酶切大片段和目标基因酶切小片段。将PCR产物与T载体、连接酶缓冲液以及T4DNA连接酶混合连接，在16℃下反应12 h以上。质粒DNA转化：1）在-80℃冰箱中取感受态细胞50μL融化，与质粒1μL轻轻混合放冰上30 min；
2）调42℃水浴锅，将混合好的离心管放入90 s，取冰于泡沫盒，将离心管转移冰上3 min；
3）取适量养好的细胞涂布于培养好的LB培养基上，室温保存30 min，待放置干燥后，将培养皿颠倒放置于37℃的培养箱中过夜，次日查看培养皿中是否有菌落。选择其中生长的一些单菌落进行酶切鉴定。
1.2.3 重组慢病毒的制备与纯化 转染前18～24 h，将2.5×106个293T细胞置于10 cm培养皿中并在37℃孵育过夜。待细胞达到65%～70%融合度即可进行转染。将转移载体和包装质粒加入Opti-MEM中，通过完全培养基来混合。将转染试剂加入同一试管中，涡旋10 s，在室温下孵育混合物15 min，将其加到培养皿中，并涡旋使其均匀分布，继续37℃条件下培养。收集上清液，换新鲜培养基继续培养2 d。将收集到的上清液倒入15 mL离心管中，2 000×g离心10 min，并用过滤器（0.22μm）过滤后转到新管中。病毒颗粒制备完成，可在4℃下储存2周，或等分后长期储存在-80℃，待用。
1.2.4 慢病毒转染U87细胞观察转染效率 在六孔板接种U87细胞30%融合度约1×105个细胞，加入MEM完全培养基，37℃及5%CO2培养12～16 h，细胞贴壁后，加入构建好的含hCD47目的基因慢病毒。继续培养3～5 d，在倒置荧光显微镜下观察48 h、72 h的荧光范围和荧光强度，以获得转染效率。
1.2.5 Western blot检测CD47蛋白表达水平 提取蛋白，分为空白对照组（NC）和转染慢病毒组（hCD47）。采用BCA法定量蛋白浓度。取定量过的蛋白相同量上样，80 V电泳。随后270 mA 60 min转至PVDF膜。加入TBST洗膜3次，每次10 min。摇床封闭2 h，封闭过后，放于一抗孵育盒，4℃过夜。次日复温30 min，TBST摇床洗膜，二抗室温孵育1.5 h。底物显色：取上述处理过的PVDF膜，ECL化学发光试剂显色。
1.3 统计学方法
采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两样本均数间的比较采用t检验。各独立实验均重复3次。P≤0.05为差异有统计学意义。
2.1 重组质粒pLVX-hCD47-3flag-ZsGreen-Puro的鉴定
利用限制性内切酶NotI+BamHI对重组慢病毒载体进行双酶切酶鉴定，在（1.0～2.0）kb可见扩增带，且与目标hCD47片段大小（1 058 bp）一致。鉴定结果表明，质粒pLVX-hCD47重组慢病毒载体克隆为阳性克隆，见图1。
图1 酶切鉴定结果
2.2 pLVX-hCD47-3flag-ZsGreen-Puro重组慢病毒载体转染293T细胞
hCD47重组慢病毒pLVX-hCD47-3flag-Zs-Green-Puro转染293T细胞，显微镜下观察转染24 h绿色荧光的强度以及白光图，并用逐孔稀释梯度法进行滴度测定。结果显示转染24 h后荧光强度增强，测得pLVX-hCD47病毒滴度为1×108TU·mL-1，表明hCD47慢病毒转染细胞后可能随着细胞传代稳定遗传，见图2。
图2 hCD47重组慢病毒载体转染293T细胞24 h荧光图（×400）
2.3 pLVX-hCD47-3flag-ZsGreen-Puro重组慢病毒载体转染HEK293细胞
pLVX-hCD47-3flag-ZsGreen-Puro重组慢病毒1μL转染HEK293细胞，转染后24 h在倒置荧光显微镜下可见明显绿色荧光，转染效率在90%以上，见图3。
图3 hCD47重组慢病毒载体转染HEK293细胞24 h荧光图（×400）
2.4 pLVX-hCD47-3flag-ZsGreen-Puro重组慢病毒载体转染U87细胞
重组慢病毒转染U87细胞48 h、72 h后，倒置荧光显微镜下可见GFP荧光，其中72 h荧光强度明显，接着进行稳转细胞株筛选，见图4。
图4 hCD47重组慢病毒载体转染U87细胞（×40）
2.5 Western blot检测U87细胞中CD47蛋白表达水平
结果显示，hCD47组CD47蛋白表达水平高于NC组（P＜0.05），提示转染hCD47目的基因效果明显，见图5。
图5 Western blot检测CD47蛋白表达水平
CD47是一种分布广泛的50 kDa五跨膜受体，它包括细胞内的C端跨膜蛋白以及细胞外的N端IgV结构域，具备四种有差异的选择性剪接亚型，仅在细胞质段长度上有所不同[12]。其可以在人体内编码获得，可以与整合素、SIRPα以及血小板生成素（TSP-1）作用，其中与SIRPα作用时，CD47可以发出“Don’t eat me”信号阻碍巨噬细胞的吞噬进而防止免疫系统伤害健康细胞[13-15]。由于CD47普遍出现在人类细胞中且过表达于多种癌细胞中，因此，CD47可能参与了免疫系统对肿瘤监视的逃逸。
近年来，大量研究[16-17]表明，CD47在大多数肿瘤细胞中高表达，利用抗CD47抗体对肿瘤生长抑制和预防各种癌症转移有明显作用。因此，CD47作为一种预测各种癌症的因子被研究，发现CD47表达与大多数肿瘤细胞的侵袭预后有关，如非小细胞肺癌[18-19]、胃癌[20]、口腔鳞状细胞癌[21]和黑色素瘤[22]等。当CD47与SIRPα作用时，可抑制巨噬细胞吞噬功能进而保护健康细胞，因此利用CD47单抗的功能，可中断CD47与SIRPα的结合，起到抗肿瘤作用，也有研究[23-24]表明，阻断CD47可加强肿瘤被巨噬细胞吞噬的能力。胶质母细胞瘤是神经系统中恶性程度最高的一种星形细胞瘤，研究[25]显示，胶质母细胞瘤的侵袭性可以通过CD47激活PI3K/AKT途径增强。此外，研究通过比较CD47在胶质母细胞瘤与正常脑标本和星形胶质细胞中的表达，发现CD47在胶质母细胞瘤中高表达，且在U87细胞株中表达最为明显[26-27]。由于胶质瘤的侵袭性与CD47过表达相关，因此CD47分子可作为多种癌症的治疗靶点。
慢病毒是在人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）的基础上发展起来的治疗载体[28]。在已有研究基础上，本研究为探讨hCD47在恶性肿瘤中的作用，制备了hCD47基因重组慢病毒。首先采用PCR扩增hCD47目的基因，将扩增产物与载体连接，得到重组质粒pLVX-hCD47-3flag-ZsGreen-Puro，双酶切结果鉴别出阳性克隆目的基因。成功构建含hCD47目的基因的慢病毒载体，将重组慢病毒载体pLVX-hCD47-3flag-ZsGreen-Puro导入293T细胞，实现了慢病毒包装，再用hCD47基因重组慢病毒转染HEK293细胞，HEK293是研究探讨基因性能的一个强有力工具，其来源于胚肾，相比其他细胞株更容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株[29]。转染HEK293细胞后在倒置荧光显微镜下会观测到绿色荧光，用梯度浓缩法测滴度为1×108TU·mL-1。将构建好的hCD47重组慢病毒转入恶性胶质瘤U87细胞中，通过观测荧光及白光强度范围获得转染效率，结果在72 h转染效率高达90%，表明制备的含目的基因的慢病毒可以有效转染U87细胞。Western blot结果同样证实了CD47在hCD47转染的U87细胞中表达升高，提示随着细胞传代，CD47基因可稳定遗传。
综上所述，本研究成功构建出hCD47慢病毒载体，且能够有效转染U87细胞，获得稳定过表达CD47的U87细胞系，为CD47在恶性肿瘤中的作用机制的深入研究及临床实践奠定基础。
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