卫逸君, 张安琪， 邵一帆， 李海北， 陈天姣， 师丹阳， 杨 栋， 李君文， 金 敏
(军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所， 天津 300050)
抑郁症是一种严重影响患者身心健康的精神紊乱疾病，在临床上可见情绪低落、思维迟缓、行为迟钝、意志消沉、悲痛欲绝，严重者会产生自杀倾向或伴随妄想等精神病性症状〔1〕。抑郁症已成为全球性健康难题，其发病率逐年增加，全世界总患病人数约达四亿〔2〕。此外，因为传染病等非精神类疾病的发展过程中常常伴随精神类疾病，所以抑郁症等精神类疾病也能够增加非精神类疾病的发病率〔3〕。
肠道菌群是肠道微生态系统的重要组成部分，广泛参与各种生理活动，正常菌群有助于机体维持神经、内分泌、免疫等功能〔4-5〕。大量研究表明大脑和肠道之间存在着双向通讯系统，肠道微生态通过“微生物-脑-肠轴”作用于中枢系统〔6〕。因此，肠道菌群的改变与多种生理和精神疾病密切相关。抑郁等不良情绪能够通过应激反应改变肠道通透性、破坏肠粘膜屏障并激活其免疫机制，从而导致肠道菌群结构紊乱〔7〕。相应地，通过补充肠道益生菌等方法调节肠道菌群可以有效改善抑郁症状〔8〕。本研究以大鼠为研究对象，通过构建受不可预知性慢性应激的抑郁大鼠模型，观察抑郁前后肠道菌群的变化，为揭示抑郁症的发展机制奠定基础。
1.1 实验动物SPF级雄性Wistar大鼠16只，体重(150±10)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供〔批号：SCXK(京)2016-0006〕。大鼠饲养场所为SPF级动物房，实验过程保证室温23-25 ℃，相对湿度40-60%，昼夜明暗交替12 h，大鼠自由进食和饮水。
1.2 主要仪器电子天平(上海津平科学仪器有限公司)；
台式高速冷冻离心机(Sigma-Aldrich上海贸易有限公司)；
立式压力蒸汽灭菌器(上海沪西分析仪器厂)；
高纯水装置(Millipore，卫生装备研究所)；
Qubit2.0荧光仪(美国Thermo公司)。
1.3 主要试剂蔗糖、生理盐水溶液、75%乙醇(天津市大茂化学试剂厂)。
2.1 抑郁大鼠的获得实验初期，按照糖水基线测试结果将16只大鼠随机分为对照组和应激组，每组各8只，每两只一笼进行饲养。应激组接受不可预知性慢性应激(unpredictable chronic stress, CUS)，对照组不接受任何应激，同时确保对照组饲养于和应激组相同的环境但不受到应激过程产生的声音和气味影响。应激因素包括短时项目(包括束缚、空瓶刺激、夹尾、热水游泳以及冷水游泳)和长时项目(禁水、禁食、倾斜45度、潮湿100 ml、无垫料、彻夜照明以及频闪)。每天随机给予应激组大鼠短时项目和长时项目各一种，持续28天。实验第4周时，应激组大鼠的糖水偏好率出现明显下降(从70%下降到43%)，确定获得抑郁大鼠。
2.2 糖水偏好实验快感缺失是抑郁的重要症状，而糖水偏好率降低能有效反映啮齿动物出现快感缺失。待大鼠禁水禁食14小时后，进行糖水偏好测试，单笼饲养，每个笼子分别放置1%的蔗糖水和普通水各一瓶一小时，期间30分钟交换两水瓶的位置以避免位置依赖性产生的干扰。1h后通过称量两水瓶重量变化计算糖水偏好率。
糖水偏好率(%)=糖水饮用量/(糖水饮用量+普通水饮用量)。
2.3 大鼠肠道微生物分析获得抑郁大鼠模型后，将大鼠单笼放置于灭菌空笼，待其产出粪便，迅速装入灭菌冻存管于液氮中速冻，并转移至-80℃冰箱保存。随后，将大鼠粪便样本送至Illumina NovaSeq PE250平台进行16s rDNA测序。
3.1 菌群结构分析应激组和对照组大鼠的大肠菌群构成存在差异，两组共有955个OTU，相对于对照组(170个OUT)，应激组(71个OUT)的独有成分较少。主坐标分析(Principal Co-ordinates Analysis, PCoA)采用线性模型，样品间的距离越近表示它们的肠道菌群构成相似度越高。二维分析图(图1A)显示，应激组肠道微生物的群落结构相似，聚集在中间区域，而对照组聚集在右下角区域，两者有明显区分。
Anoism分析可用于组间差异显著性检验，来判断组间差异是否大于组内差异。Anoism分析结果(图1B)显示，R=0.463(P=0.001)，说明应激组和对照组的组间差异大于组内差异，两组组间差异具有极显著性。主坐标分析和Anoism分析均说明应激组和对照组大鼠的菌群结构之间存在差异。
图1 菌群结构分析(A)主坐标分析；
(B)Anoism分析
3.2 物种多样性分析通过检验应激组和对照组α多样性的六种指数(observed species指数、shannon指数、simpson指数、chaol指数、ACE指数、PD whole tree指数)，可以描述测序结果单个样品多样性，并进行组间差异分析。从图2可以看出，应激组六种指数均低于对照组，其中，除shannon指数和simpson指数外，两组其余四个指数的差异均有统计学意义(P<0.05)。所以，综合结果表明应激组的物种多样性低于对照组。
图2 六种指数的组间差异分析与对照组比较:*P<0.05
3.3 物种组成分析门水平上的物种相对丰度图(图3A)显示，在所有样品中，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和柔壁菌门(Tenericutes)为优势菌，总占比达98.79%，其中厚壁菌门(Firmicutes)为最明显的优势菌(81.82%)，拟杆菌门(Bacteroidetes)和柔壁菌门(Tenericutes)分别占9.44%和7.52%。此外，与对照组相比，应激组大鼠肠道菌群中厚壁菌门(Firmicutes)和柔壁菌门(Tenericutes)相对丰度较高，拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度较低。根据物种丰度选取排名前10的物种，并做其与样品的聚类热图，由此得到的聚类热图可以直观看出在两组中哪些物种丰度较高。
物种丰度聚类热图(图3B)显示，除三种优势菌外，应激组大鼠肠道菌群中放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和无法确定的分类的细菌(unidentified Bacteria)的相对丰度高于对照组，变形菌门(Proteobateria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)和广古菌门(Euryarchaeota)相对丰度较低。物种相对丰度图和聚类热图均说明应激组和对照组大鼠肠道菌群物种组成存在显著差异。
图3 物种组成分析(A)物种相对丰度图；
(B)聚类热图
肠道菌群种类繁多，数量巨大，人体自身细胞数量仅为肠道细菌数量的十分之一。肠道菌群在生理状态下维持稳态，参与营养物质吸收、维生素和氨基酸的合成、能量供应、消化道免疫、药物和毒物的代谢、肠道生物屏障等多项生理功能〔9〕。当肠道稳态被一系列内外因素打破，例如宿主的生理发育状态、生活习惯和饮食结构等改变，肠道菌群的生存环境会产生变化，其构成和功能也会发生改变，从而引起各种菌群失调症状。研究证明，机体和肠道微生物及其代谢产物通过神经、内分泌和免疫途径相互调节，从而维持肠道微生态平衡〔10〕。
此外，“微生物-脑-肠轴”学说已经得到了分子生物学方面的证实〔11〕。肠道菌群失衡会引起2型糖尿病、肠炎、癌症和抑郁等各种疾病，对人类健康有很大影响〔12-13〕。肠道菌群的组成与抑郁之间存在密切关联。Davis等人〔14〕发现瘤胃球菌种丰度的增加与小鼠抑郁样行为(如快感缺乏)的增加有关。研究表明，与正常受试者相比，重度抑郁症患者的肠道菌群中，Eggerthella、Holdemania和Gelria等菌属显著增加，而Prevotella和Dialister菌属显著减少〔15〕。同时，重症抑郁症患者的抑郁行为和生理特征会随着其肠道菌群的移植而转移〔16〕。
本研究选取的CUS模型利用长期且不可预知的刺激引发动物抑郁行为，其机制接近人类抑郁症〔17〕。经CUS造模后，大鼠的糖水偏好率显著下降说明其出现快感缺失症状，抑郁大鼠模型建立成功。随后，采取16S rDNA测序的方法分析抑郁大鼠肠道菌群的变化。首先进行了主坐标分析和Anoism分析，证明了抑郁大鼠和正常大鼠的菌群结构之间存在差异。其次，α多样性分析说明了抑郁大鼠肠道菌群的物种多样性低于正常大鼠。与之类似，研究证明，肠炎等肠道疾病会导致肠道菌群物种多样性显著降低〔12〕。第三，通过物种组成分析发现，抑郁大鼠肠道菌群中厚壁菌门(Firmicutes)和柔壁菌门(Tenericutes)的相对丰度较高，拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度较低。许多研究证明拟杆菌门(Bacteroidetes)作为肠道菌群中的优势菌群，与抑郁症存在密切关联〔18〕。本研究发现厚壁菌门(Firmicutes)的增加和拟杆菌门(Bacteroidetes)的减少与抑郁的发生有关，这与一项重症抑郁患者肠道菌群的研究结果一致〔19〕。
肠道菌群作用于中枢及周围神经系统，通过多种直接或间接的方式调控神经递质，导致宿主精神行为改变，从而引发或加重抑郁。肠道微生物的代谢产物作为神经递质或者其前体作用在肠道上皮细胞上，调节肠道上皮细胞的内分泌或旁分泌功能。同时，肠道菌群的的变化会引起肠腔局部环境的改变，肠道的淋巴细胞感受到变化后释放细胞因子进入中枢神经系统发挥调节作用〔8〕。此外，肠道内分泌细胞释放的肠肽可以刺激感觉神经元末梢，从而产生一系列神经冲动进入大脑〔20〕。
肠道菌群广泛参与调控人体多种生理功能，影响人体身心健康，本研究以抑郁大鼠为模型，研究其肠道菌群变化，发现抑郁大鼠肠道微生态紊乱，菌群失调，物种多样性显著降低，为基于肠道菌群研究抑郁的发展机制奠定重要基础。
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